Dev Cell | 周斌研究组利用谱系示踪技术无缝隙捕捉体内肿瘤转移中的EMT过程

周斌研究组利用双同源重组系统创建诱导型无缝隙谱系示踪技术，揭示乳腺癌转移中EMT的异质性，发现原位肿瘤细胞通过N-Cadherin依赖的EMT形成大部分肺转移灶，而Vimentin依赖的EMT不参与肺转移灶形成。研究背景与争议乳腺癌是女性最高发癌症，易通过血液或淋巴系统转移至肺、骨、肝等器官，威胁生命。肿瘤转移中上皮细胞向间充质细胞转换（EMT）的作用存在争议：体外实验支持EMT对转移的重要性，但缺乏体内直接证据；近年有研究提出体内转移可能不需要EMT。传统技术的局限性传统依赖Cre-LoxP的单同源重组谱系示踪技术难以捕捉体内瞬时表达的基因，不适用于示踪肿瘤模型中瞬时、可逆的EMT过程。研究方法创新技术创建：基于双同源重组系统创建诱导型无缝隙谱系示踪技术（EMTracer系统），以自发性乳腺癌肿瘤模型小鼠MMTV-PyMT为研究对象。基因敲入小鼠构建：利用Kit-CreER标记小鼠乳腺管腔上皮细胞，构建N-Cad-LSL-Dre和Vim-LSL-Dre基因敲入小鼠，利用双同源报告基因小鼠NR1同时示踪发生过和未发生过EMT的乳腺肿瘤细胞。EMTracer系统工作原理：Kit-CreER与报告基因NR1的LoxP发生重组，标记Kit+的乳腺管腔上皮细胞为绿色荧光蛋白（ZsGreen），谱系示踪其在乳腺稳态维持中的细胞命运。Kit-CreER与EMTgene-LSL-Dre的LoxP发生重组，切掉介于两个LoxP之间的stop序列，当发生EMT后，EMTgene启动表达，使Dre表达并与报告基因NR1的Rox发生同源重组，切掉Rox-LoxP-stop-LoxP-ZsGreen-PolyA-Rox序列，启动红色荧光蛋白（tdTomato）表达，实现EMT监测。Dre持续表达，实现对EMT过程的持续监测，弥补诱导型CreER的缺陷。研究结果EMT的异质性：乳腺癌转移过程中，肿瘤细胞的EMT具有异质性。原位肿瘤细胞会发生N-Cadherin依赖的EMT，这些细胞贡献形成了大部分的肺转移灶；而原位发生Vimentin依赖的EMT的肿瘤细胞不会贡献形成肺转移灶。细胞特性分析：通过流式分选将发生过N-Cadherin依赖的EMT的乳腺原位肿瘤细胞分选出来，发现这些细胞高表达间充质细胞的分子标记和转录因子，且在体外培养具有更强的侵袭能力。基因敲除实验：利用N-Cad flox小鼠在乳腺原位肿瘤细胞中特异性敲除N-Cadherin，会减少肺转移灶的形成；而Vimentin全敲的乳腺肿瘤小鼠依然可以形成肺转移灶。图A，利用双同源重组酶介导的EMT示踪工作原理。图B，不间断捕捉短暂、可逆的细胞命运过程，如EMT。图C，乳腺癌肿瘤转移过程中依赖N-cadherin而非Vimentin介导的EMT过程。研究意义为乳腺癌肿瘤转移的临床防治提供了重要基础信息和新的研究方向。创建的诱导型无缝隙谱系示踪技术也可用于发育或其他肿瘤模型中EMT的研究。研究团队与支持该研究工作由博士后李燕、博士生吕赞等在周斌研究员的指导下完成。得到了复旦大学施奇惠教授、暨南大学蔡冬青教授、Albany大学吴明福教授、上海营养健康所胡国宏研究员、香港中文大学吕爱兰教授、南方医科大学冯景教授及西班牙神经研究所Angela Nieto教授的大力协助。