Cell 子刊 | 中国科大王毅团队发表PROTAC分子肝癌免疫治疗新成果

中国科学技术大学王毅课题组在Cell子刊Molecular Therapy发表研究成果，开发了一种针对BPTF的PROTAC降解剂，可增强NK细胞对肝癌细胞的免疫治疗效果。研究背景肝癌特征与治疗现状：肝细胞癌（HCC）具有侵袭性强、治疗效果有限的特点。免疫疗法作为晚期HCC有前景的治疗手段，得到临床前和临床数据的支持。外周血和肿瘤组织中NK细胞数量增加且功能增强的HCC患者，生存前景更好、预后更乐观，因此基于NK细胞的免疫治疗在HCC治疗中潜力巨大。然而，HCC细胞可能通过下调NK细胞识别配体（如HSPGs）表达来逃避NK细胞介导的免疫监视。BPTF的作用：BPTF是ATP依赖性核小体重构因子（NuRF）复合物核心亚基，其高表达在调控染色质结构和基因转录中发挥重要作用，可促进癌症发展。针对BPTF的高度特异性抑制剂有望增强基于NK细胞的抗肿瘤反应效果。研究目的利用PROTAC技术设计和合成一系列降解剂，高效降解BPTF并削弱其功能，随后利用蛋白组等技术在体外/体内评估PROTAC增强NK细胞识别和清除HCC细胞的有效性。研究内容与结果1. BPTF调控HPSE表达并与H3K4me3相关BPTF表达与HCC预后：159名HCC患者队列蛋白组分析和免疫印迹结果显示，肿瘤组织中BPTF表达显著上调，且晚期患者BPTF表达略高于早期患者。GEPIA2数据库182名HCC患者生存数据显示，BPTF高表达与患者无病生存率降低相关，表明BPTF过表达可能是HCC患者预后不良的指标。BPTF与HPSE表达的关系：基于TCGA数据库HCC患者队列，肿瘤组织中HPSE表达显著升高，且HPSE与BPTF表达呈正相关。BPTF敲除Huh7细胞转录组结果表明，BPTF敲低显著降低HPSE mRNA表达，说明BPTF在调控HPSE表达中发挥作用。BPTF与H3K4me3共同调控HPSE基因表达：CUT&Tag测序分析揭示BPTF和H3K4me3在HPSE启动子区域峰值存在空间重叠，表明二者可能共同调控HPSE基因表达。免疫共沉淀（IP）实验证实BPTF与H3K4me3在Huh7细胞中直接相互作用。进一步CUT&Tag实验显示，BPTF和H3K4me3被招募到HPSE启动子区域，且BPTF敲低并未导致H3K4me3水平改变，表明BPTF作为H3K4me3“阅读器”来激活HPSE表达。抑制BPTF可降低HCC细胞中HPSE水平。2. 针对BPTF的PROTACs设计与合成利用PROTAC技术开发了4种高效BPTF降解剂（8a - d），化合物8d显示出更强的结合亲和力，在溶液环境中更具优势。理论上，这些PROTAC候选物可促进BPTF与E3连接酶之间的接近，致使BPTF泛素化，随后通过蛋白酶体机制降解。3. PROTACs在HCC细胞中表现出对BPTF的选择性降解化合物8d的降解效果：免疫印迹分析显示化合物8d在降解目标蛋白方面优于化合物8a - c。蛋白质组学分析进一步研究8d降解效果选择性，8d处理组中980种蛋白表达水平降低，BPTF是显著降低蛋白之一。8d处理组与BPTF敲低组下调蛋白一致性达到89.9%，证实了8d诱导的降解效果与BPTF siRNA非常相似。“洗脱”实验结果表明，8d介导BPTF降解是可逆的。8d诱导BPTF降解的机制：将8d与特定抑制剂（Poma、MG132、TP238）联合使用，添加这些抑制剂可以有效逆转8d诱导的BPTF降解，表明8d与BPTF和CRBN E3连接酶之间的相互作用在促进BPTF降解中发挥了关键作用。此外，8d处理的Huh7细胞中BPTF泛素化显著增加，表明8d诱导BPTF下调是通过泛素介导降解实现的。这些发现证实8d通过直接招募CRBN，促进BPTF蛋白酶体选择性降解。4. PROTAC处理增强NK细胞对HCC细胞的效应功能抑制BPTF可激活NK细胞反应：与对照细胞相比，人类原代NK细胞对BPTF敲低Huh7细胞细胞毒性显著增强，表明抑制HCC细胞BPTF可以有效激活NK细胞反应。化合物8d增强NK细胞介导的细胞毒性：将效应细胞/靶细胞（E/T）比例设定为1/20进行人类原代NK细胞与Huh7细胞共培养，经8d预处理的Huh7细胞与原代NK细胞共培养时，NK细胞表现出显著增强的细胞毒性，表明8d在增强NK细胞介导的细胞毒性方面优于TP238。8d处理对HCC细胞和NK细胞的影响：免疫印迹进一步研究显示8d处理Huh7细胞中HCC细胞上HSPGs水平增加。人类原代NK细胞与经8d预处理Huh7细胞共培养时，与NCRs（NKp30、NKp46）、NKG2D和CD69相关激活受体水平显著升高。此外，与对照或TP238预处理HCC细胞共培养的原代NK细胞相比，多效性效应NK细胞比例显著增加。这些发现支持8d处理增强了