Mol Cell丨吴强组发现Cas9切割DNA末端的多样性，破除了已有的认识

上海交通大学吴强教授课题组在《Molecular Cell》发表的研究揭示了Cas9核酸酶切割DNA双链能产生突出末端，而非传统认为的平头末端，阐明了DNA片段编辑的机制，发现了染色质重排接头处的特定碱基加入规律，实现了可预测的DNA片段编辑。研究背景与意义CRISPR/Cas9系统作为新一代基因编辑技术，在多个领域广泛应用，但对Cas9核酸酶的切割原理和切割后的修复机制研究较少。染色体重排与恶性肿瘤等遗传疾病密切相关，基因编辑技术为相关疾病的研究和治疗提供了帮助，但关于CRISPR双链断裂和DNA损伤修复的机制研究不多。前期工作基础吴强教授课题组长期致力于基因组DNA大片段敲除技术研究。2015年，课题组博士生李金环和寿佳合作发表了关于DNA片段编辑的研究工作，开发了基因组DNA大片段编辑的遗传方法。同年，该团队利用这一方法对基因组DNA元件进行反转，结合计算生物学，发现了CTCF在三维基因组染色质高级结构折叠的重要规律，相关研究结果发表在《Cell》杂志上。2018年6月，该团队利用基因编辑技术研究原钙粘蛋白脑发育功能获得重要进展，发表于《eLife》上。最新研究成果发现Cas9切割DNA双链产生突出末端通过in vivo的DNA片段编辑技术，并结合高通量测序及体外断裂实验，发现Cas9核酸酶切割DNA双链能够产生突出末端，而不仅仅是之前研究报道的平头末端断裂方式。Cas9所介导的DNA片段编辑产生的碱基加入来源于Cas9切割产生突出末端的多样性，突出末端再通过细胞内DNA聚合酶的碱基补平连接机理实现PAM位点上游区段的特定碱基的加入。打破原有认知自CRISPR/Cas9新一代基因编辑系统建立以来，人们普遍认为Cas9核酸酶切割DNA双链是产生平头末端的。特别是早在2012年，CRISPR/Cas研究的先驱Doudna和Charpentier发表在《Science》的研究论文，以及Siksnys发表在《PNAS》的研究论文，均发现Cas9切割DNA产生平头末端。证明碱基插入的可预测性成对的靶向RNA介导的CRISPR删除、反转及重复等DNA片段编辑的双链断裂末端的核苷酸加入呈现非常有规律的模式。通过一对靶向RNA分子指引Cas9切割的四种不同PAM构型，结合测序技术和基因工程技术，证明Cas9介导的碱基插入在DNA片段编辑中是能够预测的。这一可预测的染色体重排方法，为研究人类染色体异常等相关疾病提供技术支持，进而有望推动相关领域的发展。证明Cas9切割末端的多样性通过基因工程改造Cas9核酸酶，使其具有不同的突出末端切割模式，进一步证明了Cas9切割末端的多样性。对DNA双链断裂修复机制的新认识DNA双链断裂修复的重要性DNA双链断裂修复对于维持基因组稳定性具有重要作用。细胞内主要的双链断裂修复机制包括同源重组和非同源末端连接（NHEJ），其中同源重组通路是精准的，而NHEJ通路是随机的。NHEJ修复通路又包括canonic NHEJ （cNHEJ） 和alternative NHEJ（alt-NHEJ）两种相互竞争的非同源末端连接途径。当细胞通过NHEJ通路修复DSB时，在DNA片段的连接处随机发生indel（插入删除）突变会降低DNA片段精准编辑的效率。提高基因组DNA片段精准编辑的效率敲除或干扰在alt-NHEJ修复途径中起到关键作用的DNA修复蛋白CtIP和FANCD2，能够显著提高CRISPR/Cas9系统介导的基因组DNA片段精准编辑的效率。明确NHEJ修复途径的精准性通常认为随机的NHEJ修复途径其实与同源重组一样，是一种精准的DNA修复通路，为DNA修复领域一直以来具有争议的问题给出了明晰答案。研究总结与展望研究总结该研究开发了通过调控细胞修复系统实现精准的DNA片段编辑方法，发现Cas9切割能够产生突出末端，而且cNHEJ是一种精准的修复通路，阐明了DNA片段编辑的机制，发现了染色质重排接头处的特定碱基加入的规律，实现了可预测的DNA片段编辑。这项研究为进一步理解DNA双链断裂修复机制，以及三维基因组DNA片段的编辑应用奠定了重要基础。研究展望在基因组编辑工具CRISPR技术飞速发展的今天，该研究系统的阐述了如何利用细胞内修复蛋白介导精准的DNA片段编辑，有望推动对三维基因组染色体异常等遗传疾病的相关研究。