新的ngs流程该如何学习之m6A学习大纲

学习m6A相关的NGS流程，我们可参照其他NGS组学技能的学习方法。以我录制的多个NGS组学数据分析教学视频为例，这些视频在B站免费提供，同时建立了交流群，你若认真研究我五年前设置的这些NGS教学大纲，就会明白如何学习一个新的NGS流程。入门级工程师首先应掌握生物信息学编程基础知识，包括基于R语言的统计可视化以及基于Linux的NGS数据处理。强调计算机基础知识在生物信息学数据分析学习过程中的重要性，可将其分为基于R语言的统计可视化和基于Linux的NGS数据处理。学习m6A建库原理和分析流程时，关键步骤包括提取RNA并注意避免RNA降解，确保RNA质量满足特定标准。接着进行RNA打断片段化，富集m6A修饰的抗体进行IP文库构建，同时创建Input文库以对比分析。分析过程中，需要关注m6A修饰区域的Reads堆叠情况。此外，利用fastqc、multiqc、fastp等可视化软件进行数据质量的评估。数据过滤环节，使用TrimGalore、Trimmomatic等软件去除原始数据中的低质量reads，确保Q20和Q30值分别达到95%和85%的标准。比对至参考基因组则可选择Hisat2、STAR等比对工具，生成SAM文件，并使用samtools、sambamba、picard等工具进行文件过滤，剔除低质量比对、多重比对、重复比对以及比对至black list region的reads。在RNA甲基化生信分析中，通过exomePeak、MeTPeak等软件鉴定m6A修饰，进一步分析差异m6A修饰。使用exomePeak、MeDiff、QNB、RADAR等工具鉴定差异基因，并通过ChIPpeakAnno、ChIPseeker等软件进行peak的注释和可视化分析。随后，进行功能富集分析，利用AllEnricher、clusterProfiler、ReactomePA等软件进行基因功能富集。最后，使用HOMER、MEME等工具进行motif鉴定，以了解m6A-seq建库时的序列特征。通过与RNA-seq数据的关联分析，进一步探索m6A修饰与基因表达之间的关系。实践环节中，可参照He lab的m6A-seq_analysis_workflow，通过完成这一流程，最终成功发表在2020年11月的文章，展示了这一方法在乳腺癌研究中的应用实例。